Hücre kültürü ortamı, hayvan hücrelerinin in vivo büyüme ortamını yapay olarak taklit etmek ve in vitro olarak hücrelerin hayatta kalmasını ve çoğalmasını sürdürmek için besin temelidir. bir besin. Peki hücre kültür ortamı kullanımında karşılaşılan yaygın sorunlar nelerdir? Bir analiz yapalım.
1. Tampon sistemi seçimi ve hücre kültürü ortamının pH değişimi
Çoğu hücre için optimum pH 7.{1}} ile 7.4 arasında olduğundan, bu aralıktan sapmaların hücre büyümesi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Bununla birlikte, çeşitli hücrelerin pH gereksinimleri tam olarak aynı değildir. Birincil kültürlenmiş hücreler genellikle pH dalgalanmalarına karşı zayıf bir toleransa sahipken, sonsuz hücre dizileri güçlü bir toleransa sahiptir. Bu nedenle birincil kültürde, kültür ortamındaki tampon sistemi daha önemlidir. Genel hücre kültürü ortamı, dengeli bir tuz sistemi kullanır, ancak farklı kültür ortamları veya aynı kültür ortamı serisi, farklı dengeli tuz sistemleri kullanır. Örneğin, 199 serisi ve MEM serilerinin tümü, Hanks'in sistem kültürü ortamına ve Earle'ün sistem kültürüne sahiptir. temel. RPMI1640 ortamı, F12 ortamı gibi bazı ortamlar yukarıda belirtilen geleneksel dengeli tuz sistemi değildir. MEM düşük serum ortamının dengeli tuz sistemi de geleneksel bir dengeli tuz sistemi değildir ve dengeli tuz sisteminin tamponlama kapasitesi geleneksel dengeli tuz sisteminden daha güçlüdür.
hücre kültürü
Hücre kültürü sırasında pH düşüşünün birçok nedeni vardır. Hücreler çok hızlı büyüdüğünde, pH değeri genellikle hızlı bir şekilde düşer ve bu, zamanında geçiş, geçiş oranının arttırılması veya serum hacminin azaltılması ile çözülebilir. Ek olarak, kültür şişesi kapağının aşırı sıkılması, NaHCO3 tampon sisteminin yetersiz tamponlama kapasitesi, kültür ortamındaki yanlış tuz konsantrasyonu, bakteri, maya veya mantar kontaminasyonu da sıklıkla pH'ın hızla düşmesine neden olabilir. Şu anda, aşağıdaki şekillerde çözebilirsiniz:
1) Kültür ortamındaki NaHCO3 konsantrasyonunu artırın veya inkübatördeki CO2 konsantrasyonunu azaltın. NaHC03 içeriği 2.0 g/L ile 3.7 g/L arasında olduğunda, karşılık gelen CO2 konsantrasyonu yüzde 5~10'dur;
2) CO2-bağımsız bir kültür ortamına geçin;
3) Şişe kapağını uygun şekilde gevşetin. Nihai konsantrasyonu 10-25 mM yapmak için kültür ortamına HEPES tamponu ekleyin;
4) Earle tuzu bazlı kültür solüsyonunu CO2 kültür ortamında kullanın ve Hanks tuzu ile hazırlanan kültür solüsyonunu atmosferik kültür ortamında kullanın;
5) Sebep kontaminasyon ise kültürü atın veya antibiyotiklerle sterilize edin.
2. Hücre kültürü ortamlarında yaygın olarak kullanılan birkaç önemli katkı maddesi ve kullanım sürecinde dikkat edilmesi gereken sorunlar
Fenol kırmızısı, hücre kültürü ortamında pH'ın bir göstergesi olarak kullanılır. Genel olarak, ortamın pH değeri fenol kırmızısının gösterge etkisiyle değerlendirilebilir, ancak düşük serumlu veya serumsuz hücre kültürü ortamındaki fenol kırmızısı içeriği sıradan hücre kültürü ortamındakinden farklıdır ve gözlenemez. çıplak gözle veya pH değeri ampirik olarak belirlenir ve ölçüm için bir pH metre kullanılması önerilir. Fenol kırmızısı genellikle serum içeren hücre kültürü ortamında üretilen biyolojik ürünlerin kalitesi üzerinde önemli bir etkiye sahip değildir ve saflaştırma teknikleriyle de uzaklaştırılabilir, ancak fenol kırmızısı serumsuz hücre kültürü ortamında hücre içi sodyum/potasyum dengesizliğine neden olabilir. , hücre büyümesini etkiler.
hücre kültürü plakası
Sodyum bikarbonat esas olarak hücre kültürü ortamında bir tampon sistemi olarak kullanılır ve ayrıca ozmotik basıncı düzenleme etkisine sahiptir. Genellikle ürün kullanım talimatlarında tavsiye edilen sodyum bikarbonat miktarı, bilimsel bir temelde pratik deneyime dayalı olarak elde edilen standart ve güvenli bir miktardır. Bununla birlikte, farklı hücre dizileri (suşları) nedeniyle, aynı hücre farklı ortamlara uyum sağlayabilir (farklı hücre toleransı, vb.) işlemi, ancak kullanımına karşılık gelen testleri (fizikokimyasal ve hücre üretim testleri vb.) yapması gerekenler.
HEPES, 7,2 ila 7,4 pH aralığında iyi tamponlama kapasitesine sahip iyonik olmayan bir tampondur ve yüksek konsantrasyonlarda bazı hücreler için toksik olabilir. HEPES tamponu, ek HEPES eklenmesinin neden olduğu ozmotik basınçtaki artışı dengelemek için düşük seviyelerde sodyum karbonat (0,34g/L) ile birlikte kullanılabilir. Güvenli konsantrasyon aralığı 10 ~ 25 mmol/L'dir.
Sodyum piruvat, hücre kültüründe alternatif bir karbon kaynağı olarak kullanılabilir ve hücreler, bir karbon kaynağı olarak glikozu tercih etseler de, hücreler, glikoz yokluğunda da sodyum piruvatı metabolize edebilirler.
Glutamin solüsyonda çok kararsızdır. 4 derecede 1 hafta yüzde 50'ye kadar ayrışabilir. Kullanım sırasında ayrı olarak hazırlamak, -20 derecelik bir buzdolabında saklamak ve kullanmadan önce hücre kültürü ortamına eklemek en iyisidir.
