1 - Kurtarma
●1. Cryovial'ı sıvı nitrojenden çıkarın, hemen 37 derecelik su banyosuna koyun ve hafifçe çalkalayın. Sıvı eridikten sonra (yaklaşık 1-1,5 dakika), onu çıkarın ve biraz alkol püskürtün ve ultra temiz tezgah üzerine koyun.
●2. Yukarıdaki hücre süspansiyonunu 10 ml ortamla doldurulmuş 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aspire edin (duvara yapışan tüm hücreleri yıkamak için kriyoprezervasyon tüpünü ortamla yıkayın) ve 1000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
●3. Süpernatantı dökün ve hücreleri askıya almak için 1 ml ortam ekleyin. 10 ml kültür ortamı içeren 10 cm'lik bir petri kabına aspire edildi ve petri kabındaki hücrelerin eşit şekilde dağılması için ileri geri hafifçe sallandı.
●4. Hücre tipini ve tarihini, yetiştiricinin adını vb. etiketleyin ve ekim için bir CO2 inkübatörüne yerleştirin. Hücreler duvara yapıştıktan sonra ortamı değiştirin.
●5. Her 3 günde bir ortamı değiştirin.
2. Geçiş
●1. Kültür kabındaki hücre kapsamı yüzde 80'e -90 ulaştığında geçiş.
●2. Orijinal ortamı aspire edin.
●3. Uygun tripsin ekleyin (hücreleri kaplayacak kadar) ve 1-2 dakika sindirin.
●4. Hücreler yuvarlandıktan sonra, sindirimi sonlandırmak için eşit hacimde serum içeren ortam ekleyin.
●5. Pipetleme yaparak hücreleri askıya almak için bir pipet kullanın.
●6. Hücreleri 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne aspire edin ve 1000 rpm'de 5 dakika santrifüjleyin.
●7. Süpernatantı boşaltın, 1-2ml ortam ekleyin ve hücreleri şişirin.
●8. Hücre tipine bağlı olarak hücreleri birkaç tabağa aktarın. Genel olarak 5 kanser hücresi ve 3 normal hücre vardır. Yetiştirmeye devam edin.
3. Kriyoprezervasyon Hücreleri sindirin ve santrifüjleyin (ibid.). Hazırlanan dondurma solüsyonu ile hücreleri askıya alın ve sterilize edilmiş kriyoviallere dağıtın, birkaç dakika bekletin ve hücre tipini ve kriyoprezervasyon tarihini belirtin. 30 dakika için 4 derece, 30 dakika için -20 derece, gece boyunca -80 derece ve ardından depolama için sıvı nitrojen içerisine yerleştirildi. Kriyoprezervasyon solüsyonunun hazırlanması: yüzde 70 tam ortam artı yüzde 20 FBS artı yüzde 10 DMSO. DMSO yavaş yavaş damla damla eklenmeli, damlarken çalkalanmalıdır.
