1. Kültür plakasında, her seferinde 3 dakika boyunca üç kez PBS ile tırmanılan slaytları ıslatın.
2. Slaytları yüzde 4 paraformaldehit ile 15 dakika sabitleyin ve slaytları her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez PBS'ye batırın.
3. Yüzde 0,5 Triton X-100 (PBS içinde hazırlanmış) ile oda sıcaklığında 20 dakika geçirgenleştirin (hücre zarında eksprese edilen antijenler için bu adım atlanmıştır).
4. Serum bloke etme: Slaytları her seferinde 3 dakika boyunca 3 kez PBS'ye daldırın, PBS'yi emici kağıtla kurutun, lamların üzerine normal keçi serumu ekleyin (ikincil antikor kaynağının keçi olması şartıyla) ve oda sıcaklığında blok yapın. 30 dk.
5. Primer antikoru ekleyin: Bloke edici solüsyonu emici kağıt ile emdirin, yıkamayın, her slayta yeterli miktarda seyreltilmiş primer antikor ekleyin ve ıslak bir kutuya koyun, gece boyunca 4 derecede inkübe edin.
6. Floresan sekonder antikor ekleyin: slaytları her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez PBST'ye batırın, emici kağıtla slaytlardaki fazla sıvıyı emdirin, seyreltilmiş floresan sekonder antikoru damla damla ekleyin, 20-37 derecede 1 saat inkübe edin ıslak bir kutuda, her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez PBST Dilimine batırın.
Not: Floresan sekonder antikorun eklenmesinden sonraki tüm adımlar mümkün olduğunca karanlık bir yerde gerçekleştirilmelidir.
7. Serum bloke etme: sıvıyı emici kağıtla lekeleyin, cam slayt üzerine normal keçi serumu damlatın (ikincil antikor kaynağının keçi olması şartıyla) ve oda sıcaklığında 30 dakika bloke edin.
8. Birincil antikoru ekleyin: Bloke edici solüsyonu emici kağıtla emdirin, yıkamayın, ardından seyreltilmiş birincil antikoru damla damla ekleyin ve birincil antikoru ekledikten sonra karanlıkta 4 derecelik nemli bir kutuda gece boyunca inkübe edin. (Not: İkinci birincil antikorun türü, fare ve tavşan gibi birinci birincil antikorun türünden farklıdır)
9. Floresan sekonder antikor ekleyin: slaytları her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez PBST'ye batırın, emici kağıtla slaytlardaki fazla sıvıyı emdirin, seyreltilmiş floresan sekonder antikoru damla damla ekleyin, 20-37 derecede 1 saat inkübe edin ıslak bir kutuda, her seferinde 3 dakika olmak üzere 3 kez PBST Dilimine batırın. (Not: İlk antikorun saptanması için kırmızı floresan seçilirse, ikincisi diğer floresan renklerini seçmelidir)
10. Karşıt boyama çekirdekleri: DAPI damla damla ilave edildi ve karanlıkta 5 dakika inkübe edildi, numuneler boyandı ve fazla DAPI, 5 dakika x 4 kez PBST ile yıkandı.
11. Slayt üzerindeki sıvıyı emici kağıtla kurutun, slaydı anti-floresan söndürücü içeren montaj sıvısıyla kapatın ve floresan mikroskobu altında gözlemleyin ve görüntüleri toplayın.