Hücre kültürü nedir?
hücre kültürü
Hücre kültürü, hücrelerin doğal ortamlarının dışında kontrollü koşullar altında büyütülmesi sürecini ifade eder. Hücre biyolojisi ve hastalık mekanizmalarının anlaşılmasını kolaylaştıran bir in vitro araçtır. Ayrıca ilaç toksisite testleri ve farmakokinetik/farmakodinamik çalışmalar gibi ilaç keşfinde ve kişiselleştirilmiş tıpta da rol oynar.
Amerikalı embriyolog Ross Granville Harrison, ilk in vitro hücre kültürü tekniklerini 20. yüzyılın başlarında, kurbağa embriyolarından doku parçalarını in vitro olarak başarıyla büyüttüğünde geliştirdi. Günümüzde hücre kültürü, çocuk felci, kızamık, kabakulak ve diğer bulaşıcı hastalıklara karşı aşıların geliştirilmesi gibi sayısız keşfe yardımcı olmuştur.
Yapışma ve Süspansiyon Kültürü
Hücre büyümesi için iki temel sistem vardır: yapışık kültür ve süspansiyon kültürü. Yapışkan kültürler yapay substratlar üzerinde büyütülürken, süspansiyon kültürlerindeki hücreler ortamda serbestçe yüzer. Süspansiyonda sadece birkaç hücre tipi doğal olarak büyürken (örneğin lenfositler), birçok yapışık hücre tipi süspansiyon kültürüne adapte edilebilir.
Süspansiyonda doğal olarak yapışık hücrelerin kültürlenmesinin iki nedeni vardır. Süspansiyon kültürünün ilk avantajı, hücrelerin geçişinin daha kolay olmasıdır çünkü onları kültür kabından enzimatik veya mekanik olarak ayırmanıza gerek yoktur. İkincisi, süspansiyon kültürlerinin ölçeklendirilmesi daha kolaydır çünkü hücre büyümesi mevcut yüzey alanıyla değil, yalnızca ortamdaki konsantrasyonları ile sınırlıdır. Süspansiyon kültürlerinin ana dezavantajı, büyüme modellerini takip etmek için günlük hücre sayımları ve canlılık deneyleri gerektirmeleri, oysa yapışık kültürlerin mikroskop altında kolayca incelenebilmesidir.
2B ve 3B yöntemler
Bağlı kültürler ayrıca 2B ve 3B kültürlere ayrılabilir. 2D uygulamalarda, yapışık hücreler, bir hücre kültürü şişesi gibi düz bir yüzey üzerinde tek tabakalı bir sistemde büyütülür.
hücre kültürü
Basitliği nedeniyle 2D teknolojisi, tipik olarak karmaşık hücreden hücreye etkileşimlerle üç boyutlu yapılarda büyüyen hücrelerin in vivo ortamını taklit edemez. Bu nedenle, iskele tabanlı veya iskelesiz teknolojiler kullanılarak büyütülebilen 3B kültürler kullanılarak bazı deneyler yapılır.
İskele tabanlı 3B yöntemler tipik olarak hidrojel yapı iskelelerinde büyüyen yapışık hücreleri içerir. Bazı uygulamalar için biyoseramik, metal veya polimer yapı iskeleleri gibi alternatifler de kullanılmaktadır.
İskelesiz teknikler, küremsileri üç farklı yöntemden biriyle büyütmek için kullanılır:
Zorla Yüzdürme: Hücre süspansiyonunu düşük aderanslı polimer kaplı bir mikroplakanın kuyularına yükleyin. Mikroplaka daha sonra hücreleri sferoidler oluşturmaya zorlamak için santrifüjlenir.
Asılı damla: Hücre süspansiyonu, asılı bir damla plakasının kuyucuklarına yüklenir. Adından da anlaşılacağı gibi, süspansiyon plaka üzerinde damlacıklar halinde asılı kalacaktır. Hücreler bu damlacıkların uçlarında toplanacak ve küreler oluşturacaktır.
Ajitasyona dayalı: Hücre süspansiyonu, dönen bir biyoreaktöre yerleştirilir. Sürekli ajitasyon nedeniyle, hücreler duvarlara yapışamadı ve böylece sferoidler oluşturdu.
Hücre Kültürü Mücadelesi
Yöntem ve tekniklerdeki farklılıklara rağmen, tüm deneylerin ortak bir noktası vardır: tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gerekli sayıda canlı hücre yetiştirmek zordur. Bu nedenle, aşağıdaki bölümler dört zorluğa ayrılacaktır - tekrarlanabilirlik, kirlilik, fizibilite ve otomasyona geçiş.
Yeniden üretilebilirlik
Yongyue Medical tarafından yapılan bir ankete göre, bilim adamlarının yüzde 70'inden fazlası başka bir bilim insanının deneylerini tekrarlamada başarısız olduklarını ve yarısından fazlasının da kendi çalışmalarını tekrarlamada başarısız olduğunu bildirdi. Hücre kültürü tahlillerinde, çoğu tekrarlanabilirlik sorunu, hücre pasajları veya kuşakları arasındaki biyolojik farklılıklardan kaynaklanır. Diğer bir büyük sorun da hücre hatlarının yanlış tanımlanmasıdır ve kültür parametrelerindeki tutarsızlıklar da önemli bir rol oynar.
biyolojik varyasyon
Rastgele mutasyonlar veya transkripsiyon hataları gibi faktörler, bir hücre her bölündüğünde deneylerin tekrarlanabilirliğini etkileme potansiyeline sahiptir. Bunu önlemek için, yeni bir projenin başında bir hücre bankası oluşturmalısınız.
hücre bankası
Hücre bankacılığı, tekrarlanabilirliği etkileyen rastgele mutasyonlar veya transkripsiyon hataları gibi faktörlerden kaçınmak için belirli hücre tiplerinin partilerini daha sonra kullanmak üzere saklama sürecini ifade eder. İlk adım, kültürde ilgilenilen seçili hücre tiplerini büyüterek ve bunları birden fazla kapta dondurarak saklayarak bir ana hücre bankası (MBC) oluşturmaktır. MBC yığınları eritilir ve daha sonra çalışan hücre bankalarını (WBC'ler) hazırlamak için kullanılır.
Hücre hatlarının yanlış tanımlanması
Hücre hattı yanlış tanımlama sorunu, bir bilim adamının diğer 19 insan hücre hattının HeLa hücre kontaminasyonunu tanımladığı 1960'lardan beri bilinmektedir. Sonuçlarınızın güvenilir olduğundan ve daha da önemlisi yanlış sonuçlara varmadığınızdan emin olmak için, laboratuvara giren tüm yeni hücre dizilerini kökenleri doğrulanana kadar karantinaya almalısınız. En önemlisi, dondurarak saklama ve diğer laboratuvarlara dağıtmadan önce ve proje tamamlandıktan sonra hücre hattı kalifikasyonunun tekrarlanması önerilir. Bir hücre hattını doğrulamak için, önce yanlış tanımlanmış hücre hattı kaydında listelenip listelenmediğini kontrol etmelisiniz. Kayıtlı değilse, yine de orijinalliğini onaylamanız gerekir. İnsan hücre hatları için kısa ardışık tekrar (STR) analizi (DNA parmak izi) önerilir. İnsan dışı hücre dizileri için karyotipleme, izoenzim analizi ve mitokondriyal DNA tipleme (DNA barkodlama) dahil olmak üzere çeşitli test yöntemleri mevcuttur.
Kültür parametreleri
Tekrar üretilebilirliği etkileyen üçüncü bir faktör, kültür parametreleridir.
Örneğin, oksijen seviyeleri kültürlenmiş hücreleri önemli ölçüde etkileyebilir. Bununla birlikte, hazne boyutu veya hücre yoğunluğu gibi oksijenasyonu etkileyen değişkenler her zaman belgelenmez ve bu nedenle tutarlı tutulamaz.
Bir diğer önemli kültür parametresi ortamdır. Bu, gerekli besinleri, büyüme faktörlerini ve hormonları sağlar ve pH ile ozmotik basıncı düzenler. Bu nedenle en önemli şey, bileşiminin her zaman aynı olmasıdır. Bu, bileşimi ineğin diyeti, coğrafi konumu ve yılın zamanı gibi faktörlere bağlı olan fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş besiyeri formülasyonları için özellikle önemlidir. FBS'nin sonuçların tekrarlanabilirliği üzerindeki etkisini en aza indirmek için mevcut stoklar azalmaya başladığında farklı serum partileri sipariş etmeli ve en yakın eşleşmeyi bulmak için bunları test etmelisiniz. Başkalarının sonuçlarınızı yeniden üretebilmesi için serumu nasıl taradığınızı rapor etmeli ve lot numarasını kaydetmelisiniz.
hücre kültürü
Hücre işleme
Çoğu araştırmacı, kültür parametrelerinin uygulamaları üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğunu bilir, ancak işleme tekniklerindeki değişiklikler genellikle göz ardı edilir.
Kirlilik
Hücreler dokudan izole edildiğinde ve laboratuvarda büyütüldüğünde, artık bağışıklık sistemi tarafından korunmazlar ve bu nedenle kontaminasyona karşı son derece savunmasızdırlar.
İlk kontaminasyon kaynağı, kültür ortamı, serum, takviyeler veya sudaki safsızlıklar gibi abiyotik kontaminantların yanı sıra endotoksinler ve sızıntılardır. Önlemler arasında hücre kültürü deneyleri için laboratuvar kalitesinde su ve endotoksin testi sertifikası sunan üreticilerin ortamları, serumları, takviyeleri ve sarf malzemeleri yer alır. Ek olarak, plastik katkı maddelerinin hücre kültürünüze sızmamasını sağlamak için sarf malzemeleri işlenmemiş polistiren veya polipropilenden yapılmalıdır.
İkinci bulaşma kaynağı, bakteri (mikoplazma dahil), mantar ve maya gibi biyolojik kirletici maddelerdir.
fizibilite
Hücre canlılığı, bir numunedeki canlı hücrelerin oranı olarak tanımlanır. Az önce gördüğümüz kirleticilere ek olarak, hücre canlılığını etkileyen çeşitli başka faktörler de var. Çevresel koşullar—sıcaklık, pH, ozmotik basınç, besin mevcudiyeti ve O2 ve CO2 konsantrasyonları—çok önemlidir. Bu değişkenlerin çoğu ortam tarafından kontrol edilir ve hücre tipine özgüdür, bu da ne yazık ki belirli yönergeler sağlayamayacağımız anlamına gelir.
Hücreler basınca karşı çok hassas oldukları için sadece çevre koşullarına değil, sıvı taşıma tekniklerinize de dikkat etmelisiniz.
Hücre yaşayabilirliğini etkileyen son bir faktör yaşlanmadır. Sonlu hücre dizilerinin çoğu ölmeden önce 20 ila 60 bölünmeden sonra hayatta kalır, bu da onların yalnızca 15 ila 45 nesil arasında yeniden kullanılabileceği anlamına gelir. Daha sonra dondurularak saklanan numunenin hücre bankasından çözülmesi gerekir. Kesintisiz hücre hatları süresiz olarak çoğalabilir, ancak genetik sürüklenmeye eğilimli oldukları için düzenli olarak değiştirilmeleri gerekir.
Hücre canlılığını ölçmek için kolorimetrik, florometrik ve biyolüminesan yöntemleri kullanan tespit deneyleri kullanılabilir. Yaygın olarak kullanılan bir kolorimetrik yöntem, sarı tetrazolyum tuzlarının canlı hücreler tarafından mor formazan kristallerine indirgenmesine dayanan MTT yöntemidir.
96-kuyu plakaları
otomasyon
Yukarıda açıklanan zorlukların çoğu, hücre kültürü iş akışlarını otomatikleştirerek çözülebilir. Örneğin, hücre kullanımı her zaman tutarlı olacak ve yeniden üretilebilirliği ve yaşayabilirliği olumlu yönde etkileyecektir. En önemlisi, otomasyon kullanıcı kontaminasyonu riskini azaltır.
Bu avantajlara rağmen, tüm iş akışlarını otomatikleştirmek, bütçe nedenlerinden, robotlar için yer olmamasından veya her adımı aynı anda otomatikleştirmek ve doğrulamak için yeterli kaynak olmamasından dolayı zor olabilir. Ama bu çözülebilir!